リボヌクレアーゼ PNPase は、リステリア モノサイトゲネスにおけるバイオフィルム形成の重要な調節因子であり、宿主細胞の侵入に影響を与えます。

npj Biofilms and Microbiomes volume 9、記事番号: 34 (2023) この記事を引用

69 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

バイオフィルムは、栄養剥奪、抗生物質治療、免疫防御などの外部ストレスから微生物を保護する環境を提供し、それによって細菌の生存と病因にとって好ましい条件を作り出します。 今回我々は、RNA結合タンパク質およびリボヌクレアーゼポリヌクレオチドホスホリラーゼ（PNPase）が、食品加工環境における食品汚染の主要な原因であるヒト病原体リステリアモノサイトゲネスにおけるバイオフィルム形成の正の制御因子であることを示す。 PNPase 変異株は生成するバイオフィルム バイオマスが少なく、抗生物質による治療に対してより感受性の高い変化したバイオフィルム形態を示します。 私たちは、生化学的アッセイと顕微鏡分析を通じて、PNPase がこれまで認識されていなかったバイオフィルム細胞外マトリックスの組成の調節因子であり、タンパク質、細胞外 DNA、糖のレベルに大きな影響を与えていることを実証しました。 注目すべきことに、我々は蛍光錯体ルテニウムレッドフェナントロリンの使用をリステリアバイオフィルム中の多糖の検出に適応させた。 野生型および PNPase 変異体バイオフィルムのトランスクリプトーム解析により、PNPase が、特に炭水化物、アミノ酸の代謝に関与する遺伝子 (例、PTS 成分をコードする lmo0096 および lmo0783) の発現に影響を与えることにより、バイオフィルム形成に関連する多くの制御経路に影​​響を与えることが明らかになりました。 (例、生合成酵素をコードする lmo1984 および lmo2006) および Agr クォーラム センシング様システム (lmo0048-49)。 さらに、我々は、PNPase が病原性のマスター調節因子である PrfA および PrfA 調節遺伝子の mRNA レベルに影響を与えることを示し、これらの結果は、ΔpnpA 変異体のヒト細胞における細菌内部移行の減少を説明するのに役立つ可能性がある。 全体として、この研究は、PNPase が病原性とグラム陽性菌のバイオフィルムのライフスタイルへの適応にとって重要な転写後調節因子であることを実証し、病原性における重要な役割を果たすリボヌクレアーゼの役割の拡大を強調しています。

バイオフィルムは、自然生態系における微生物の一般的な増殖様式です。 しかし、微生物感染症の 80% がバイオフィルムに関連しており 1,2、慢性感染症の持続の一因となっている 3 ことを考えると、医学的懸念が高まっています。 バイオフィルムは、生物または非生物の表面に付着し、バイオフィルムマトリックスとしても知られる自己生成する水和細胞外高分子物質 (EPS) に囲まれた微生物のコミュニティとして定義されます 4,5。 多糖類、タンパク質、リン脂質、および核酸は、バイオフィルム細胞外マトリックスの主成分です6。 固着性微生物は周囲のマトリックスによって保護されており、浮遊性細菌よりも栄養剥奪や乾燥などの外部ストレスにはるかに耐えることができ、抗菌剤の作用や宿主の免疫防御の影響もはるかに受けにくい7。 バイオフィルムの構造は、溶解した細胞の成分の蓄積を可能にし、細菌間の水平遺伝子伝達と細胞間コミュニケーションを促進します6,8。

バイオフィルムの形成は、感染を促進することによっていくつかの病原性細菌の毒性と関連しています。 リステリア モノサイトゲネス (リステリア) は、ヒトにおける最も致死性の高い食中毒の 1 つであるリステリア症を引き起こすグラム陽性病原菌です9。 それは細胞内で生存し、宿主の細胞機械を操作し、免疫系から逃れることができます10。 L.モノサイトゲネスは、低温、低pH、高塩濃度などの悪環境条件に耐えます11。 さらに、この細菌はさまざまな種類の表面に付着し、食品加工環境でバイオフィルムの形で残り、食品を汚染する可能性があるため、食品業界にとって大きな負担となっています12、13、14、15。 静的条件下で増殖した場合、リステリア・モノサイトゲネスのバイオフィルムは細菌の単層の形をとることもあれば、蜂の巣状のバイオフィルムを形成することもあります17。 また、連続流動条件下ではボール状の構造を形成することもできます18。

バイオフィルムの形成は複雑で多要素のプロセスです。 他の細菌性病原体と同様に、L.モノサイトゲネスにおいても、遊泳能力19とAgrクオラムセンシング様システムがバイオフィルム形成の初期段階で重要であり、後者は細胞への接着に関連するタンパク質の制御に関与していることが示されている。表面および/または細菌20、21。 さらに、病原性の転写制御因子 PrfA とストレス応答制御因子 σB は両方とも、actA、inlA、rmlA などの遺伝子の発現を制御することによって、リステリア菌のバイオフィルムの発達に重要です 22,23,24,25。 例えば、PrfA 調節因子 ActA は、バイオフィルム形成の重要なステップである細菌の凝集に関与していることが示されています 24。 PrfA は、哺乳動物細胞株の侵入に不可欠な表面タンパク質インターナリンなど、いくつかの病原性因子の発現に関与しています 10,26。 さらに、sRNA 27,28 や c-di-GMP 29,30 など、他の因子も病原性細菌のバイオフィルム形成に関与しています。

他の細菌種でバイオフィルム形成を調節することが判明したもう 1 つの因子は、RNA 結合タンパク質ポリヌクレオチド ホスホリラーゼ (PNPase) です。 これは、RNA の分解とプロセシングを触媒する高度に保存された 3'-5' エクソリボヌクレアーゼであり 31、さまざまな細菌種における毒性関連プロセスに関与していると考えられています 32、33、34。 我々は以前に、PNPase が L. monocytogenes の CRISPR エレメントのプロセシングと機能において重要な酵素であることを発見しました 35。 グラム陰性菌である大腸菌 K-12 およびネズミチフス菌血清型では、PNPase の不活性化によりバイオフィルム形成が損なわれることが示されています 36、37、38。 しかし、大腸菌 C 株では、PNPase 欠失変異体はバイオフィルム形成の増加を示しました 39。 したがって、バイオフィルム形成における PNPase の役割はまだ十分に説明されていない一方、PNPase がグラム陽性菌におけるバイオフィルム形成に影響を与えるかどうかはまだ不明です。

この研究では、L. monocytogenes における PNPase の不活化により細胞浸潤が減少し、バイオフィルム生成に大きな欠陥が生じ、細胞外マトリックス組成に大きな影響を与えることを示します。 また、RNA シーケンス分析により、PNPase がバイオフィルム形成に影響を与える別の経路、つまりクオラム センシングと炭水化物とアミノ酸の代謝の調節に関与していることが示されました。 したがって、我々は、グラム陽性病原体における新しいバイオフィルム調節因子として PNPase を紹介します。

PNPase は、その役割がまだ完全には理解されておらず、細菌ごとに異なる可能性があるにもかかわらず、さまざまな細菌種の毒性関連プロセスに関与していると考えられています (参考文献 31 で概説)。 PNPase が L. monocytogenes の病原性に重要であるかどうかを判断するために、野生型 (WT)、PNPase 欠失変異体 (ΔpnpA)、および PNPase 補完型 (ΔpnpA::pnpA) 株の宿主細胞への侵入能力をテストしました。 そのために、我々は 2 つの十分に確立されたヒト上皮細胞株、HeLa (子宮頸がんから単離され、研究モデルとして一般的に使用される) と HepG2 (肝臓がリステリア感染の好ましい標的であるため、肝細胞由来細胞) を使用しました。 細菌培養物を使用してヒト細胞を 1 時間感染させた後、細胞外細菌を殺すゲンタマイシンで 1 時間処理しました 40。 宿主細胞溶解後に細胞内細菌を回収し、BHI寒天プレート上で生存率を測定しました。 私たちの結果は、ΔpnpA変異体が野生型よりも侵襲性が低いため（HeLaでは約95％、HepG2では約80％減少）、両方の細胞株への侵入にはPNPaseが必要であることを示しました（図1）。 相補された株は、HeLa の感染では部分的な回復を示し、HepG2 の感染では完全な相補を示しました。 これらの結果は、PNPase が L. monocytogenes 感染にとって重要であることを示しています。 この事実は、他の病原性細菌について記載されているものと一致しており 34 、細菌の毒性における PNPase の役割を強調しています。

感染後 2 時間の HeLa および HepG2 細胞における細胞内細菌の定量。HeLa では MOI 50、HepG2 では MOI 40 で行われます。 平均反復値を接種材料濃度(感染時のCFU/mL)に対して正規化し、変換されたデータを野生型に対する生存細菌の割合として表した。 データは、3 つの独立した実験の平均 ± SD を表します。 有意性は対応のない t 検定によって決定されました。 *P < 0.05、**P < 0.01。

細胞のサイズ、形状、運動性の変化は、これらの形質が宿主の侵入に影響を与える可能性があるため、細菌性病原体の病原性欠陥と関連していると考えられています41,42。 リステリア モノサイトゲネス EGD-e (野生型) と ΔpnpA 変異体培養物による宿主細胞の定着能力の違いが、これらの菌株間の表現型の変化に起因する可能性があるかどうかを判断するために、まずそれらの顕微鏡的な細胞形態を分析しました (図 2a)。 ）。 これら 2 つの株または相補株の間で細胞サイズの有意な差は見つかりませんでした。 次に、BHI 寒天プレート上で増殖させたすべての株のマクロコロニーの形態を分析しました。 そして顕著な違いが観察されました（図2b）。 すべてのコロニーは、滑らかな形態の周辺領域に囲まれた同心円状のリングを備えた中心コアによって特徴付けられました。 それにもかかわらず、野生型および相補マクロコロニーの外側領域は分葉状の端を示していたのに対し、ΔpnpA 変異体はより規則的な滑らかな成長ゾーンを示しました。 野生型は粒状の外観を示したため、最も顕著な違いは内部領域で見つかりました。 代わりに、ΔpnpA 変異体は斑点状の形態を示し、これは内核に限定されませんでしたが、マクロコロニー全体で観察され、表面の中空状の構造に似ていました (各マクロコロニーの代表的な領域の拡大画像がよりわかりやすく示されています)さまざまな特徴を視覚化します) (図 2b)。 この表現型は相補株では観察されず、野生型で見られる粒状の外観により似ていました。 鞭毛と運動性も病原性と関連しているため、PNPase がリステリアの遊泳能力に影響を与えるかどうかを評価することにしました。 野生型およびΔpnpA変異体の培養物をBHI-軟寒天プレート上にスポットした(図2c)。 PNPase を欠失させると、野生型と比較して、株の運動性が低下 (約 70% 低下) しました。 この欠陥のある表現型は、PNPase 補完株では完全に回復しました。

a 細胞サイズと形態を評価するための、指数関数期中期（OD600 0.7〜0.8）の個々の細菌細胞の代表的な画像。 スケールバー、1 μm (左)。 各株の 2 つの独立した生物学的複製の平均細胞サイズの棒グラフ (右)。 データは平均値 ± SD を表します。 有意性は対応のない t 検定によって決定されました。 ns、重要ではありません。 *P < 0.05。 b ズーム顕微鏡を使用したマクロコロニー観察の代表的な画像。 各株をBHI寒天プレートに接種し、37℃で8日間インキュベートしました。 下のパネルはズーム倍率に対応します。 スケールバー、1000 μm。 c 0.3% (w/v) BHI 寒天培地にスポットし、25 °C で 48 時間インキュベートした細菌培養物からの遊泳運動性評価の代表的な画像 (左)。 各系統の遊泳エリアの棒グラフ (右)。 平均反復値を、野生型と比較した運動性のパーセンテージとして変換した。 データは、3 つの独立した実験の平均 ± SD を表します。 有意性は対応のない t 検定によって決定されました。 **P < 0.01、***P < 0.005。

まとめると、これらの結果は、PNPase の不活化が表現型の変化を引き起こし、コロニーの形態や細胞の運動性に差異が見られ、この株の低侵襲性と相関していることを示しました。

コロニーの形態と運動性は、細菌バイオフィルムの形成に影響を与えることが知られている 2 つの相互に関連した表現型です 43,44。 リステリア モノサイトゲネスの PNPase 変異体で見つかった形態型の変化と運動性の欠陥がバイオフィルムの形成に影響を与える可能性があるかどうかを判断するために、次に野生型、ΔpnpA、および相補株によって生成されるバイオフィルムの量を比較しました。 細菌を、24 ウェル プレート内の BHI 培地中で 37 °C で静的に増殖させました。 浮遊細胞を除去して洗浄した後、表面に付着したバイオフィルムをクリスタル バイオレット (CV) で染色しました。 我々は、リステリアPNPase欠失変異体は、野生型と比較してバイオフィルム形成に明らかに欠陥がある（40％少ない）ことを観察しました（図3a）。 この表現型は、PNPase 補完株では少なくとも部分的に回復しました。 さらに、ΔpnpA変異体で観察されたバイオフィルムの形態は、他の2つの株のバイオフィルムとは著しく異なっていました（図3a、左）。 PNPase を不活化すると、PNPase を発現する細胞では検出されなかった、顕著な縞状の端を持つバイオフィルムが生成されました。 さらに、ΔpnpA 変異体のバイオフィルムが洗浄ステップ中により容易に剥がれることが観察され、このバイオフィルムは付着が少なく、構造化されていないことが示唆されました。

a バイオフィルムを 37 °C で 48 時間静的に増殖させ、クリスタル バイオレット染色法を使用してバイオフィルム バイオマスを測定しました。 左側は、クリスタルバイオレットを添加した後のバイオフィルムの画像です。 右側には、595 nm での吸光度の平均値がプロットされています。 データは、3 つの独立した実験の平均 ± SD を表します。 有意性は対応のない t 検定によって決定されました。 ***P < 0.005。 b バイオフィルムの代表的な三次元構造は、37°C​​で48時間成長させた後、CLSMによってZスタック画像を取得した後に再構築されました。 c 画像化されたバイオフィルムのバイオマス、最大厚さ、粗さ係数はCOMSTATによって定量化されました。 反復値を平均してプロットしました。 データは、3 つの独立した実験の平均 ± SD を表します。 有意性は対応のない t 検定によって決定されました。 *P < 0.05。 d 2000倍および10,000倍の倍率でSEMによって観察されたバイオフィルムの代表的な画像。

リステリアのバイオフィルム構造をさらに評価するために、共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) を使用しました。 バイオフィルムは、24 ウェル プレート上のカバーガラス上で 37 °C で 48 時間増殖させました。 次に、バイオフィルムを穏やかに洗浄して未付着の細菌細胞を除去し、細菌および細胞外 DNA45 (eDNA) を標識する細胞透過性蛍光核酸色素である SYTO™ 9 で染色しました。 各バイオフィルムの Z スタックが取得され、三次元投影に再構築されました。 図3bに示すように、リステリア野生型株は、いくつかの細胞凝集体を含む密集した細菌の芝生に似たバイオフィルムを形成しました。 対照的に、ΔpnpA 変異株は、個々の細菌細胞の間に多くの空き領域を持つまばらなバイオフィルムを形成しました。 PNPase が相補された株では、バイオフィルムは野生型株によって形成されたものと似ていました。 さらに、バイオフィルム形成における構造の違いが定量化されました（図3c）。 野生型バイオフィルムは、ΔpnpA 変異体バイオフィルムよりも多くのバイオマスを示し、著しく厚かった。 バイオフィルムの粗さに関しては、野生型バイオフィルムはΔpnpA変異体バイオフィルムよりも低い粗さ係数を示しました。これは、野生型がより均質な側面を持っているのに対し、ΔpnpA変異体は生体体積が減少し、より多くの中空空間を示しているためです。 PNPase 相補株のバイオフィルムは、バイオマスと粗さの中間値を示しましたが、Z スタック画像取得における不均一性のため、最大厚さは野生型よりも高かったです。 まとめると、これらの結果は CV アッセイから得られた情報を検証し、ΔpnpA 変異体バイオフィルム形成の減少を示しています。

PNPase が発現していない場合のリステリア菌バイオフィルム形成の減少の形態学的性質をより深く理解するために、野生型、ΔpnpA 変異体、および PNPase 補完株のバイオフィルム構造を走査型電子顕微鏡 (SEM) によってさらに研究しました。 野生型株のバイオフィルムは、ΔpnpA変異体で見られる粗くてひび割れた表面とはまったく異なる、滑らかで水和したような表面を示していることが容易に観察されました（図3d）。 倍率を高くしてみると、野生型細菌はほとんどが細胞外物質に覆われており、個々の細胞の輪郭を観察することが困難であることが分かりました。 顕著な対照的に、ΔpnpA 変異細菌は高密度の細胞外マトリックスに埋め込まれておらず、細胞は容易に検出されました。 PNPase で相補された株は、ΔpnpA 変異体よりも表面が滑らかで細胞外マトリックスの含有量が高く、野生型に近いバイオフィルム表現型を示しました。 しかし、粗いバイオフィルム表面の斑点や細胞外マトリックスに捕捉されていない細菌も検出されたため、完全な相補性ではなかったことに注目します。 ΔpnpA::pnpA 株で得られたさまざまな表現型の部分的な相補性は、おそらくここでテストしたさまざまなアッセイ条件における PNPase 発現のさまざまなレベルに関連しています。 これは、pPL2 プラスミドでクローニングするための pnpA 遺伝子の増幅に使用されたクローニング戦略の結果である可能性があり、pnpA の上流配列に位置するアクチベーター領域またはその他のプロモーターが欠落している可能性があります (「方法」を参照)。

全体として、この一連の結果は、PNPase が細胞外マトリックスの形成を妨害することによってリステリア モノサイトゲネスのバイオフィルムに影響を与えることを示しました。 リステリア PNPase が不活性化されると、バイオフィルムが減少して薄くなり、細胞外マトリックスの含有量が大幅に低下します。

リステリア モノサイトゲネスのバイオフィルムのマトリックスは、EPS、つまり eDNA、タンパク質、多糖類で構成されています 46。 以前の一連の結果に続いて、観察されたバイオフィルムの構造と形態の違いがマトリックス組成の変化によるものであるかどうかを理解するために、野生型、ΔpnpA、および相補株の高分子バイオフィルムマトリックス組成を調査しました。 37℃で48時間増殖させたバイオフィルムを非生物表面から剥がし、超音波処理にかけて細菌細胞からEPSを分離した。 超音波処理後、各株の総バイオフィルムバイオマスに対する各マトリックス成分をさらに正規化するために、OD600 を測定しました。 上清中に回収された EPS は、研究の成分に応じて、eDNA についてはフェノール-クロロホルム抽出法、タンパク質についてはブラッドフォード法、多糖類についてはフェノール-硫酸法といった、異なる生化学的手法を使用してさらに定量されました。 注目すべきことに、結果は、野生型と比較して、ΔpnpA変異株ではリステリア細胞外マトリックスの3つの主要成分の量が減少していることを示している（図4a）。 また、補完された株が野生型の表現型を部分的に回復できることも観察されました。

a 37 °C で 48 時間増殖させたバイオフィルムのマトリックス中の細胞外 DNA、タンパク質、多糖類含有量の相対定量。 平均反復値を、野生型と比較したパーセンテージとして変換した。 データは、3 つの独立した実験の平均 ± SD を表します。 有意性は対応のない t 検定によって決定されました。 *P < 0.05、**P < 0.01。 b バイオフィルムマトリックス組成の CLSM 分析の代表的な画像。 SYTO™ 9 を細菌染色のコントロールとして使用し、TO-PRO™-3 ヨウ化物を細胞外 DNA 染色に、SYPRO® Ruby をタンパク質染色に、RR-OP を多糖類染色に使用しました。

これらの結果をさらに検証し、さまざまなマトリックス成分を視覚化するために、図4bの代表的な画像に示すように、各成分の特定の色素で染色した後、48時間成長させたバイオフィルムをCLSMによって分析しました。 TO-PRO™-3 ヨウ化物蛍光色素は核酸を標的としますが、無傷の膜を持つ細菌は標的としません。 したがって、SYTO™ 9 色素と同時に使用すると、eDNA とバイオフィルム細胞内に見られる DNA を区別できるため、細胞外マトリックス上の eDNA 検出に使用されてきました45。 図4bでは、ΔpnpA変異体バイオフィルムではeDNAレベルの大幅な低下が検出され、染色された細胞はわずかでしたが、野生型バイオフィルムではeDNAの星状パターンが観察されました。 FilmTracer™ SYPRO® Ruby Biofilm Matrix 色素はタンパク質の検出に使用され 47、野生型バイオフィルムのマトリックスにあるタンパク質が豊富な凝集体に結合できましたが、ΔpnpA 変異体バイオフィルムの個々の細胞しか染色できませんでした（図 4b）。 これは、PNPase 欠損株の細胞外マトリックス中のタンパク質含量が低いことを示しています。 リステリア菌のバイオフィルムマトリックスに存在する多糖類を染色することは、より困難な手順でした。 まず、グラム陽性バイオフィルム、つまり黄色ブドウ球菌の多糖類を検出するために一般的に使用される、Alexa Fluor 633 と結合した蛍光色素小麦胚芽凝集素 (WGA) をテストしました48。 しかし、この色素は、少なくともここでテストした条件では、リステリアバイオフィルム内の多糖類の標識には効果がありませんでした。 この困難を克服するために、次に、炭水化物に結合し、リステリアバイオフィルムを染色することが知られている色素であるルテニウムレッド（RR）をテストしました49。 RR は蛍光性ではありませんが、非蛍光性の 1,10-フェナントロリン (OP) と結合すると、以前は赤血球核のクロマチンなどのアニオン性基質の標識に使用されていた蛍光性 RR-OP 複合体が形成されます 50。 我々は RR-OP を合成し、リステリア EPS に存在する多糖類を標識する能力をテストしました。 図4bで観察されたように、RR-OPはバイオフィルムマトリックスに存在する多糖にうまく結合します。 野生型マトリックスでは染色がより強かったが、ΔpnpA変異体ではあまり染色されず、変異体バイオフィルムマトリックスでは多糖類のレベルが低いことが示された。 私たちの知る限り、RR-OP がリステリアバイオフィルム上の多糖類の蛍光染色法として使用されたのはこれが初めてであり、細菌バイオフィルムの研究に役立つ可能性のある新しいツールが提供されました。 総合すると、これらの結果は、PNPase の不活性化がリステリアバイオフィルム内の EPS の減少につながり、eDNA、タンパク質、多糖類のレベルに影響を与えることを示しています。

バイオフィルムは、その強固な構造と周囲のマトリックスの保護的役割により、抗菌剤の作用に対してより耐性があります。 PNPase の不活化によりバイオフィルムが薄くなり、EPS 含有量が減少するため、次に、PNPase 欠損バイオフィルムが抗生物質治療に対する耐性が低いかどうかを評価しました。 リステリア症の治療に使用される 2 つの抗生物質、この場合はゲンタマイシンとエリスロマイシンが選択されました (これらはそれぞれ第一選択と第二選択の治療薬と考えられています 51,52)。 まず、BHI​​ ブロスで増殖させた浮遊培養物の最小発育阻止濃度 (MIC) を測定したところ、BHI-A プレートでの細菌の培養能力に関して、菌株間に差がないことが明らかになりました (ゲンタマイシンについては 3 μg/mL、エリスロマイシンについては 0.1 μg/mL)。 ）。 次に、BHI中で48時間静的に増殖させた野生型およびΔpnpA変異型バイオフィルムを、高用量の各抗生物質による処理に供した。 24 時間後、バイオフィルムを洗浄し、超音波浴にさらし、付着した細胞を非生物表面から剥がすために剥がしました。 回収したバイオフィルム細胞を、CFU/mL 評価のために BHI 寒天プレートに播種しました。 並行して、抗生物質を含まない BHI を細胞培養性の対照として使用しました。 事前に形成されたバイオフィルムに抗生物質が添加されなかった場合、野生型とΔpnpA変異体の間に有意な差はなく、PNPaseの不活性化がリステリアバイオフィルムにおける細胞の培養性に影響を及ぼさないことが示されました（図5）。 対照的に、各抗生物質処理は野生型と比較した場合、ΔpnpA 変異体の培養能を低下させましたが、この減少は 1-log 未満であることに注目しました。 この効果はゲンタマイシン処理でより顕著であった（ΔpnpA株の培養可能性は75％低下）が、エリスロマイシンを使用した場合にも培養可能性の低下が観察された（ΔpnpA株の培養可能性は40％低下）（図5）。 相補された株は、両方の抗生物質処理においてほぼ完全な相補を示しました。 これらの結果は、PNPase 変異体のバイオフィルムが野生型よりも抗生物質に対して感受性が高いことを示しています。 これは、PNPase 欠損バイオフィルムは構造が弱く、細胞外マトリックス成分が少ないという以前の観察と完全に一致します。

37℃で48時間増殖させたバイオフィルムを、高用量のゲンタマイシン（10×MIC）またはエリスロマイシン（100×MIC）で24時間処理した。 細菌の培養性の制御として、抗生物質の代わりに BHI を添加しました。 各処理後、回収された培養細胞を CFU/mL として定量しました。 反復値を平均し、野生型に対する CFU/mL のパーセンテージとして変換しました。 データは、3 つの独立した実験の平均 ± SD を表します。 有意性は二元配置分散分析によって決定されました。 ns、重要ではありません。 ****P < 0.0001。

PNPase がバイオフィルム形成における遺伝子発現にどのような影響を与えるかをより深く理解するために、ΔpnpA 変異体と野生型バイオフィルム培養物のトランスクリプトームを比較しました。 37 °C で 48 時間増殖させたバイオフィルム培養物から全 RNA を抽出し、RNA シーケンス (RNA-seq) に供しました。 RNA-seqデータから、MA散布図で各転写物の倍率変化を計算してプロットすることにより、ΔpnpA変異体と野生型バイオフィルムの間の異なる転写物発現を評価しました（図6a）。 統計的に有意な差次的発現遺伝子 (DEG) を決定するために、次のパラメータを定義しました: 誤検出率 (FDR) が 0.1 未満、倍率変化が 2 より高く、転写物の発現値 (log2 CPM) が高いlog2倍数変化値の分散はほとんどの転写産物でかなり減少しましたが、合計103個の遺伝子が差次的に発現され（補足表1）、そのうち46個がダウンレギュレートされ、57個がアップレギュレートされました（図6a）。 。 注目すべきことに、DEG がその一般的な生物学的役割に従ってグループ化された場合、DEG の大部分が「炭水化物の輸送と代謝」(n = 14) または「アミノ酸の輸送と代謝」(n = 11) のいずれかの一部であることが観察されました。 ) グループと未分類の DEG (n = 37) (図 6b)。 次に、DEG を KEGG データベースにマッピングして各遺伝子をそれぞれの経路に帰属させ、続いて KEGG 経路濃縮分析を行いました（図 6c）。 その結果、「代謝経路」(n = 36)、「二次代謝産物の生合成」(n = 22)、および「多様な環境における微生物の代謝」(n = 14)に関与する経路が豊富であることが示されました。 図 6b で確認されたカテゴリーと、図 6c で説明されている濃縮された KEGG 経路との間に良好な相関関係が観察できます。「アミノ酸の輸送と代謝」カテゴリーは、「アミノ酸の生合成」、「アラニン、アスパラギン酸」の濃縮によってサポートされています。 「およびグルタミン酸代謝」および「バリン、ロイシンおよびイソロイシン生合成」経路。 同様に、「炭水化物の輸送と代謝」というカテゴリーは、KEGG 経路「炭素代謝」、「クエン酸回路」、および「解糖/糖新生」を包括することができます。

L.モノサイトゲネスEGD-e野生型バイオフィルムとΔpnpA変異体バイオフィルムの2つの生物学的複製間の転写物の発現を比較するMA散布図。 発現が大きく異なる遺伝子は、野生型と比較してΔpnpA バイオフィルム内で上方制御されている場合は赤色で強調表示され、下方制御されている場合は緑色で強調表示されます。 FDR カットオフは <0.10 です。 2 本の水平線は、log2 倍数変化のカットオフ 1 に対応し、垂直線は log2 CPM のカットオフ 3 に対応します。NS は有意ではありません。 b 一般的な生物学的カテゴリーに分類された差次的発現遺伝子 (DEG) の全体的な視覚化。 各カテゴリーに属する遺伝子の数は白で表示されます。 c 濃縮度が大幅に増加した DEG は、予測された KEGG 経路にグループ化されました。 d DEGの転写プロファイルのヒートマップ。 階層的クラスタリングを行って、log2 RPKM の観点から類似した発現パターンを持つ遺伝子をグループ化しました。 e 3 つの上方制御された遺伝子 (lmo0096、lmo0783、lmo0784) および 3 つの下方制御された遺伝子 (lmo1984、lmo1986、lmo2006) のカバレッジ プロットを読み取ります。 lmo0783-0784はオペロンで示されています。 青線は野生型に対応し、赤線はΔpnpA変異体に対応します。 y 軸はリードの範囲を表し、各遺伝子の最大値が表示されます。 x 軸は遺伝子の位置を表します。

ヒートマップを作成し、野生型およびΔpnpA変異株におけるDEGの正規化された発現値を示しました（図6d）。 次に、それらの差次的に発現された転写物のうち6つ（3つは上方制御され、3つは下方制御された遺伝子）をRNA-seqデータの例として選択し、それらのリードカバレッジをプロットして、両方の株の配列決定の深さを評価しました（図6e）。 次に、より高いおよびより低い log2 FC を示し、文献によれば以前にバイオフィルム形成に関連している遺伝子を、代表的な遺伝子として選択しました (表 1)。 たとえば、PNPase の不活化により、クオラム センシング システム Agr (lmo0048、lmo0049) の遺伝子、マンノース/グルコース輸送システム (lmo0096、lmo0783、lmo0784) およびマルトース (lmo2124、lmo2125) 輸送システムの遺伝子が上方制御されます。ペントースリン酸経路に関与します (lmo0342、lmo0343、lmo0345)。 PNPase 不活化によって強く下方制御されたカテゴリーは、「アミノ酸の輸送と代謝」 (lmo1733、lmo1835、lmo1984、lm01986、lmo2006) と「エネルギーの生産と変換」 (lmo1052-1055) でした。 RNA-seq の結果は、これらの代表的な遺伝子のサブセットを使用した qPCR 分析によって検証されました (表 1)。 2 つの手法間に良好な相関関係が観察され、qPCR 結果が RNA-seq データと一致していることが示されました。

我々の結果は、ΔpnpA変異体バイオフィルムでは野生型と比較してバイオフィルム形成に重要な生物学的カテゴリーの発現が変化しており、PNPaseの制御下にあるDEGの大部分が炭水化物またはアミノ酸関連プロセスに組み込まれていることを示した。 。 これらのデータは、PNPase がリステリア モノサイトゲネス バイオフィルムの細胞外マトリックスからの多糖類およびタンパク質のレベルに影響を与えることを示す、我々の以前の一連の結果を裏付けるものである。

最も重要な DEG の制御における PNPase の役割をさらに評価するために、ΔpnpA 変異体と野生型培養物を比較するリファンピシン mRNA 安定性アッセイを実行しました。 バイオフィルムでこの技術を実行する際の技術的困難のため、代わりに、この増殖段階では細菌はバイオフィルム中に存在する固着細菌に生理学的に類似しているため、37℃のBHI培地で増殖させた定常期培養物を使用しました53。 特定のプローブを使用したノーザンブロットによって、目的の遺伝子の mRNA レベルを評価しました。

我々は、PNPase の不活化により、上方制御された DEG からの mRNA、すなわちクオラムセンシング様システム lmo0048/agrB、PTS トランスポーター サブユニット lmo0096/manL、および糖 ABC トランスポーター lmo2125/malE の mRNA が強力に安定化することを観察しました (表 1)。図7a)。 この安定化は、lmo0048 および lmo0096 mRNA を分析した場合に特に顕著でしたが、野生型ではかろうじて検出されるレベルしか示されず、この株では mRNA 半減期の信頼できる定量化ができませんでした。 lmo0048 プローブでは、サイズの異なる 2 つのバンドが観察されたことに注目しました。長いバンドはモノシストロン性 mRNA に対応し (WT と ΔpnpA 変異体の両方で検出されました)、短いバンドは崩壊中間体に対応しました (ΔpnpA 変異体でのみ検出されました)。 ）。 両方の mRNA 種のレベルは、野生型株と比較して ΔpnpA 変異体で高く、PNPase の非存在下でより短い転写物の強力な蓄積が特に明らかです。 mRNA が短いと、Lmo0048/AgrB 切断型タンパク質が生成される可能性がありますが、これはまだ部分的に機能しており、バイオフィルム関連経路に影響を与える可能性があります。 全体として、この一連の結果は、PNPase が、RNA-seq 解析で特定された上方制御された遺伝子の mRNA の分解に関与する主要な酵素として作用することにより、転写後制御因子として機能することを示しています。 反対に、選択された下方制御された遺伝子 (lmo2006) の mRNA は、ΔpnpA 変異体でわずかに速く崩壊することが観察され、これがおそらくこの株で観察されるこの転写物のレベルの低下に寄与していると考えられます。

a ノーザンブロットは、lmo0048、lmo0096、lmo2125、およびlmo2006の検出のために特定のオリゴでプローブされ、野生型およびΔpnpA変異株のリファンピシン処理培養物から抽出されたRNAを比較しました。 RNA の安定性は、それぞれの転写物の下に分単位で示されます。 tmRNA はローディング コントロールとして機能します。 2 つの独立した複製からの各プローブの代表的なゲルが示されています。 RNA サイズマーカーはパネルの左側に示されています。 lmo0048 プローブでは 2 つのバンドが検出されました。 対応する画像の下に示されている半減期の定量化は、より短いバンドに関連しています。 上部バンドの定量化により、野生型では 6.2 ± 0.6、ΔpnpA 変異体では 7.0 ± 0.58 の安定性が示されました。 NQ は定量化できません。 b 定常期までBHI中で増殖させた野生型およびΔpnpA変異株におけるPlmo0048-lacZ融合体およびPlmo2006-lacZ融合体の​​β-ガラクトシダーゼ活性。 データは、3 回の独立した実験の平均値 ± SEM を表します。 有意性は二元配置分散分析によって決定されました。 ns、重要ではありません。 *P < 0.05。 c 野生型株とΔpnpA変異株のリファンピシン処理培養物から抽出したRNAを比較する、prfA、hly、inlAおよびmogRの検出のために特定のオリゴを使用してプローブしたノーザンブロット。 RNA の安定性は、対応する画像の下に分単位で表示されます。 tmRNA はローディング コントロールとして機能します。 2 つの独立した複製からの各プローブの代表的なゲルが示されています。 RNA サイズマーカーはパネルの左側に示されています。 d 抗 InlA 抗体を使用した総タンパク質抽出物のウェスタンブロット分析。 抗EF-Tu抗体をローディングコントロールとして使用した。 RQ 相対定量化。

さらに、転写融合体を構築および分析して、PNPaseがlmo0048 / agrB（1つの上方制御された遺伝子）および/またはlmo2006 / alsS（1つの下方制御された遺伝子）の転写に影響を与えることができるかどうかをテストしました（図7b）。 これらの遺伝子のプロモーター活性は、pTCV プラスミドとレポーター遺伝子として lacZ を使用して分析されました54。 β-ガラクトシダーゼアッセイでは、野生型とΔpnpA変異体の間に有意差がないことが示され、これはPNPaseがこれらの遺伝子の転写に大きな影響を与えていないことを示唆しています。 lmo0048の転写に有意な変化が観察されないことを考慮すると（図7b）、図7aの2つのRNAのレベルが高いのはPNPaseの非存在下での安定化によるものであることが確認されます。 したがって、PNPase がそれらの分解の原因となります。 lmo0048 のより短い転写物は、転写の増加の結果ではありませんでした。 代わりに、このmRNAは、他のリボヌクレアーゼによるlmo0048のより長い転写産物の切断に起因する可能性が最も高く、PNPaseによって急速に除去されます。これが、このmRNAが野生型で検出されなかった理由を説明しています（図7a）。

PNPase の不活性化により、ヒト細胞株の浸潤 (図 1) と細菌の運動性 (図 2) が低下することが観察されたため、たとえ差異があるようには見えないとしても、これらの表現型にとって重要な遺伝子に研究をさらに拡張しました。バイオフィルムのトランスクリプトームデータで表現されています。 リファンピシン mRNA 安定性アッセイおよびノー​​ザン ブロット分析を使用して、PNPase の不活化により、2 つの prfA 調節遺伝子、すなわち inlA (インターナリン A をコードする) および hly とともに、病原性遺伝子の転写活性化因子である prfA の mRNA レベルが低下することが判明しました。定常期培養物中の（リステリオリシンOをコード化する）（図7c）。 これらの転写物の安定性は PNPase の不在によって強い影響を受けないため、この制御は間接的に引き起こされると考えられます。 また、ΔpnpA変異体の細胞抽出物中のインターナリンAのタンパク質レベルの低下も観察され、inlA mRNAのレベルの低下がタンパク質レベルの低下と相関していることが示されました（図7d）。 一方、我々は、PNPaseが運動性遺伝子の転写抑制因子であるmogR mRNAのレベルと安定性に影響を及ぼさないことを観察しました（図7c）。

全体として、これらの結果は、PNPase がバイオフィルムと病原性に関与する遺伝子の発現レベルを制御していることを示し、PNPase がバイオフィルム形成の転写後制御に関与する重要な酵素であることを裏付けています。

この研究では、グラム陽性病原体リステリア モノサイトゲネスにおけるバイオフィルム形成と病原性の新規調節因子としてリボヌクレアーゼ PNPase を紹介します。 我々は、PNPase が L. monocytogenes EGD-e 株におけるバイオフィルム生成の正の決定因子であり、バイオフィルムのバイオマス、形態、および構造に影響を与えることを実証します。 PNPase 欠失株は、野生型に比べて生成するバイオフィルム バイオマスの量が少なく、より薄く、よりしわが多く、表面が乾燥したように見え、バイオ フィルムの構造が劣っていました。 これは、生化学的アッセイおよび顕微鏡検査によって検出されるように、タンパク質、多糖類、および細胞外 DNA の含有量が少量であるΔpnpA 変異体のバイオフィルム細胞外マトリックスの組成における主要な欠陥と相関していました。 実際、ΔpnpA バイオフィルムに存在する細菌は、細菌が厚いマトリックスに囲まれている野生型バイオフィルムで観察されるのとは対照的に、マトリックスの層に有意に埋め込まれていることは見出されません。 これらの構造的欠陥により、ΔpnpA 変異体ではバイオフィルムの生成が弱くなり、これが抗生物質に対するリステリアバイオフィルムの感受性の増加を引き起こす可能性が最も高くなります。 さらに、リステリア PNPase の不活性化により、マクロコロニーの表現型変化と細胞運動性の低下が生じ、この 2 つの特徴はバイオフィルム形成に広く関連しています。

PNPase は、グラム陰性菌におけるバイオフィルム形成に関連していることが以前に報告されています。 ただし、その正確な役割については議論の余地があります。 PNPase は、大腸菌 K-1238 およびネズミチフス菌におけるバイオフィルム形成の正の制御因子であることが示されていますが 36,37、大腸菌 C を使用した別の研究では、バイオフィルム形成の阻害剤として PNPase が提案されています 39。 したがって、バイオフィルム生成における PNPase の効果は、少なくともグラム陰性菌では種に依存すると思われます。 それにもかかわらず、グラム陽性菌におけるバイオフィルムの確立における PNPase の役割と、そのギャップを埋めることを目的とした我々の研究については、現時点では情報が不足しています。 PNPase が L. monocytogenes のバイオフィルム形成にどのように寄与するかをより深く理解するために、野生型および ΔpnpA 変異体バイオフィルムのトランスクリプトーム解析を実行しました。 PNPase は、主要な転写後調節因子から予想されるように、いくつかの遺伝子および複数の調節経路の発現レベルに影響を与えることが判明しました。 PNPase によって影響を受けた合計 103 個の DEG (それぞれアップレギュレーションとダウンレギュレーションを示す 57 個と 46 個の遺伝子) が RNA-seq によって得られました。 DEG の大部分は、「炭水化物の輸送と代謝」グループまたは「アミノ酸の輸送と代謝」グループのいずれかに属していました。

クオラムセンシングに関与する遺伝子と炭水化物の輸送および代謝に関与する遺伝子は、PNPase を発現しないリステリアバイオフィルムで最も上方制御されている遺伝子の 1 つです (図 6 および表 1)。 黄色ブドウ球菌で最初に記載された、リステリア・モノサイトゲネスのAgrクオラムセンシング様システムは、lmo0048-lmo0051オペロンにコードされています55。 我々の結果により、ΔpnpA変異体のバイオフィルムにおける遺伝子lmo0048（黄色ブドウ球菌センサーヒスチジンキナーゼAgrBのホモログをコードする）およびlmo0049（黄色ブドウ球菌自己誘導ペプチドAgrDのホモログをコードする）の上方制御が明らかになった（図6および表1）。 ）。 Agr変異体、すなわちΔlmo0049（ΔagrD）は接着およびバイオフィルム形成の最初の24時間に影響を受けるため、Agrオペロンがリステリアバイオフィルム形成に重要であることが以前に示されている20、21、56。 L. monocytogenes agr オペロンの発現は一時的な制御を受けており、バイオフィルム成長の初期段階で発現レベルが増加し、その後バイオフィルムが成熟するにつれて減少します 13。 私たちは、agr システムのこの一時的な制御が、PNPase の不在下では欠陥があることを観察しました。 48時間の増殖後にバイオフィルムで観察される高レベルのagrBおよびagrD転写物は、ΔpnpA変異体で見られるバイオフィルムバイオマスの減少を説明するのに役立つ可能性がある。

さらに、糖の輸送と生体エネルギーに関与するいくつかの遺伝子が、ΔpnpA 変異体バイオフィルムで上方制御されていることが判明しました。 これらには、マンノースとグルコースの両方を高親和性で取り込むためのホスホエノールピルビン酸 (PEP) 依存性糖:ホスホトランスフェラーゼ システム (PTS) の遺伝子が含まれます。 PTS は、2 つの一般的なホスホトランスフェラーゼタンパク質 (EI および HPr) と、さまざまな数の糖特異的酵素 II 複合体で構成されます。 EI と HPr は、リン酸化基を PEP から、EIICD がトランスポーターとして機能し、さまざまな糖のリン酸化を担う EIIAB に移動させます 57,58。 我々の結果は、Man オペロンからの lmo0096 (EIIABMan/Glu)、および Mpo オペロンからの lmo0783 (EIIAMan/Glu) および lmo0784 (EIIBMan/Glu) の上方制御を示しています。 これらの PTS の上方制御は、解糖系 PEP の消費量の増加を表している可能性があり、その結果、芳香族アミノ酸および細胞壁前駆体の生合成におけるその利用可能性が減少します 59。 これはおそらく、リステリア ΔpnpA バイオフィルムで観察されるバイオフィルム マトリックス生成の低下に寄与していると考えられます。 この仮説と一致して、肺炎連鎖球菌 60 やエンテロコッカス フェカリス 61 の強弱バイオフィルム形成菌で観察されるように、他のグラム陽性菌でも PTS 酵素はバイオフィルム形成中にダウンレギュレートされます。 さらに上方制御される遺伝子には、マルトース/マルトデキストリンの取り込みを担うATP結合カセットトランスポーターをコードするlmo2124およびlmo2125が含まれます。これらは、後にグルコースの形で解糖に使用されます62。 また、グリセロール代謝（lmo0344、lmo0347）において、ペントースリン酸経路の非酸化相に関与する酵素（lmo0342、lmo0343、およびlmo0345）をコードするgolオペロン（lmo0341-0351）の7つの遺伝子の上方制御も観察しました。 、および lmo0348) および解糖系 (lmo0346)63,64。 まとめると、これらの遺伝子の発現量が高いということは、炭水化物の代謝が生合成経路ではなくエネルギー生産に優先的に集中していることを示唆しています。 これは、PNPase の非存在下で観察されるマトリックス成分の生合成の低下と、その結果として観察されるバイオフィルム形成の欠陥を説明するのにさらに役立つ可能性があります。

PNPase 欠損バイオフィルムで見つかった下方制御された遺伝子の中で、バイオフィルム形成に影響を与える代謝経路を特定することも同様に可能でした (図 6 および表 1)。 主要なカテゴリーはアミノ酸代謝で、イソロイシン、ロイシン、バリンなどの分岐鎖アミノ酸の合成に関与する遺伝子 lmo1984 (ilvB)、lmo1986 (ilvC)、lmo2006 (alsS) が含まれていました。 これらのアミノ酸は、さまざまな細菌において強力なバイオフィルム形成を促進することが示されています。たとえば、高レベルのロイシンとバリンが大腸菌バイオフィルムで見つかりました 65,66。 これらは、緑膿菌で同定されているバイオフィルム促進アミノ酸の 1 つです67。 そして、イソロイシン、ロイシン、およびバリンの代謝は、ビフィズス菌ビフィダムのバイオフィルム形成中に不可欠です68。 アミノ酸代謝に関与する別の下方制御遺伝子は、lmo1733 (gltD) です。これは、グルタミン酸シンターゼのより小さなサブユニットをコードし、グルタミンからグルタミン酸への変換に関与します。 このアミノ酸はバイオフィルム形成に影響を与えることも判明しており、この代謝経路の欠陥により固体表面への接着が減少し、その結果、L. monocytogenes69 および Bacillus subtilis 70 におけるバイオフィルム形成が減少します。 全体として、これらのアミノ酸遺伝子の発現の低下は、ΔpnpA 変異体で観察される細胞外マトリックスのタンパク質含量の低下およびバイオフィルムの構造化の低下と一致します。 さらに、別の下方制御された遺伝子セットは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体 (pdh オペロン) をコードする lmo1052-1055 オペロンで構成され、ピルビン酸のアセチル CoA への変換に関与します。 Streptococcus suis では、PDH のタンパク質発現はプランクトン性よりもバイオフィルム状態の方が高く 71、PDH 欠失後はバイオフィルムの形成が大幅に減少しました 72。

リファンピシン mRNA 安定性アッセイおよびノー​​ザン ブロット分析により、PNPase がバイオフィルムのトランスクリプトーム分析で同定された上方制御される遺伝子の少なくとも代表的なサブセットの分解に関与していることが明らかになりました。 ΔpnpA 変異株では、野生型株と比較した場合、lmo0048/agrB、lmo0096/manL、および lmo2125/malE からの転写産物の強力な安定化が観察されました。 lmo0048からのプロモーターとlacZとの転写融合は、野生型とΔpnpA変異株の間でβ-ガラクトシダーゼ活性に有意な差を示さなかったため、これらの転写物の高レベルは、PNPaseの非存在下での転写増加の結果ではないと思われる。 これらの結果は、PNPase がバイオフィルム形成に関与する遺伝子の重要な転写後調節因子であることを確認し、上方制御された DEG が PNPase の非存在下でのこれらの転写物の安定性の増加の結果であることを裏付けています。 これらの mRNA のレベルが高くなると、対応するタンパク質の翻訳が強化される可能性があり、したがってバイオフィルム形成経路に影響を与える可能性があります。

一方、lmo2006/alsS の mRNA は、ΔpnpA 変異体ではわずかに速く崩壊することが観察されました。 これは、PNPase が下方制御された DEG からの mRNA の安定性を制御するために間接的に作用する可能性があることを示唆しています。 例えば、PNPase は、これらの転写産物 (sRNA など) のリプレッサーのレベルを制御している可能性があります 73,74。または、大腸菌の RNase II について記載されているのと同様に、PNPase はこれらの mRNA を他のリボヌクレアーゼによる分解から保護している可能性があります 75。

さらに、PNPase はリステリアの毒性に重要な遺伝子の発現に影響を与えることが判明しました。 驚くべきことに、ΔpnpA 変異体は、病原性遺伝子の転写活性化因子である prfA の mRNA レベルの低下を示し、これは PrfA タンパク質のレベルが低いことを示唆している可能性があります。 PrfA は自動調節されているため、PrfA のレベルが低下すると病原性因子の発現が減少する可能性があると思われます 76。 実際、我々は、inlA/インターナリン A および hly/リステリオリシン O 病原性因子が、ΔpnpA 変異体と野生型株の間で mRNA 半減期に大きな差がなく、ΔpnpA 変異体における mRNA の値の減少を示すことを観察しました。 重要なことに、PNPase の非存在下ではインターナリン A のレベルが低下していることがわかりました (図 7)。 これらの病原性因子の発現が低いことは、確かに、ΔpnpA 変異体によるヒト細胞株への侵入の減少を説明するのに役立つ可能性があります。 さらに、PrfA の発現の低下は、ΔpnpA 変異体で観察されるバイオフィルムのレベルの低下に寄与している可能性があります。 以前の報告では、突然変異体が表面付着バイオフィルム形成に欠陥があることを考慮すると、PrfA および PrfA レギュロンのメンバーがリステリア モノサイトゲネスにおけるバイオフィルム生成の正の決定因子として機能することが強調されました 23,77,78。 PrfA は細胞表面因子 (インターナリン A など) や分泌タンパク質 (リステリオリシン O など) の発現を調節しており、それらの mRNA レベルも低下しているため、これらの欠陥はバイオフィルムの発達に有害な細胞表面の変化に起因する可能性があると提案されています 23。 ΔpnpA変異体。 最後に、PNPase が鞭毛運動遺伝子の転写抑制因子である MogR の制御に関与しているかどうかもテストしました。 しかし、PNPase は mogR mRNA レベルに影響を与えることは見出されず、これは、ΔpnpA 変異株で観察された運動性の欠陥が MogR とは無関係であると思われることを意味します。 したがって、PNPase に依存した細菌の運動性の制御は予想よりも複雑です。

L. モノサイトゲネスは主要な食中毒病原体であり、免疫不全患者における致死率の高い細菌感染症であるリステリア症の原因物質です9。 食品加工環境におけるバイオフィルムの存在による食品の汚染は、世界中で経済的負担を引き起こしています79。 我々は、RNA結合タンパク質とリボヌクレアーゼPNPアーゼがリステリア・モノサイトゲネスの病原性の重要な調節因子であり、宿主細胞の侵入だけでなくそのバイオフィルム形成にも影響を与えることを同定した。 さらに、リステリアバイオフィルムの発達に重要なPNPase依存性の制御経路を明らかにし、病原性細菌のバイオフィルムライフスタイルへの適応における転写後制御の重要性を強調しました。 Hfq や CsrA などの他の RNA 結合タンパク質は、特に運動性、細胞外多糖類の産生、c-di-GMP 産生などへの影響を通じて、バイオフィルム形成の制御に関与していることが示されています 29,80,81。 82.

結論として、我々は、PNPase がリステリア モノサイトゲネス バイオフィルム形成の転写後調節因子であり、PNPase の不活化によりバイオフィルム生成の減少が起こることを初めて実証しました。 我々の結果は、PNPaseが炭水化物からアミノ酸代謝およびクオラムセンシングシステムに至る複数の代謝経路に影響を及ぼし、細胞外マトリックスの生成に影響を与え、その結果非生物表面でのリステリアバイオフィルムの形成に影響を与えることを示しています。 この研究は、固着性ライフスタイルへの適応におけるRNA結合タンパク質の重要性を強調し、グラム陽性病原菌におけるバイオフィルム形成に関する我々の知識を拡大するものである。

すべての細菌株とプラスミドを補足表 2 に示します。この研究で使用した株は、リステリア モノサイトゲネス EGD-e 株 (野生型) とその同系変異体 ΔpnpA (PNPase/Lmo1331 のヌル変異体を保有) です。 PNPase の相補性は、上流 343 bps および下流 162 bps の pnpA ORF の全配列を含む PCR フラグメント (プライマー pPL2-pnpA-BamHI および pPL2-pnpA-SalI) を、ΔpnpA 変異体への組み込み後に pPL2 ベクターにクローニングすることによって得られました。結果として、相補された株 ΔpnpA::pnpA35 が得られます。 株は、Brain Heart Infusion (BHI) 培地 (BD Difco™) で日常的に増殖させました。 ΔpnpA::pnpAの増殖のために、クロラムフェニコールを最終濃度10μg/mLまで添加した。 E.coliまたはL.monocytogenes株のいずれかがpTCV誘導体を保有する場合、カナマイシンは50μg/mLで含まれた。

2 つのヒト細胞株、HeLa (ATCC® CCL-2™) および HepG2 (ATCC® HB-8065™) を使用しました。 細胞は、高グルコースおよびl-グルタミンを含み、10%ウシ胎児血清(FBS)(Biowest)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Biowest)中で80〜90%コンフルエンシーまで日常的に増殖させた。 HeLa (1 × 105 細胞/ウェル) および HepG2 (1 × 105 細胞/ウェル) を 24 ウェル培養プレートに播種し、感染前に 37 °C、5% CO2 雰囲気下で 24 時間インキュベートしました (HepG2 の場合は 48 時間) ）。 内部移行アッセイプロトコルは参考文献から適応されました。 40. 簡単に説明すると、細菌懸濁液を指定の感染多重度 (MOI) まで希釈し、細胞に添加し、37 °C で 1 時間インキュベートしました。 その後、ゲンタマイシン (40 μg/mL) を含む DMEM を添加し、37 °C で 1 時間インキュベートしました。 洗浄後、ヒト細胞を 0.1% (v/v) Triton X-100 で溶解し、段階希釈を行って回収された細胞内細菌の数を測定し、mL あたりのコロニー形成単位 (CFU/mL) として表しました。

画像は、Andor iXon 885 EMCCD カメラを備えた Leica DM 6000B 正立顕微鏡で取得し、MetaMorph V5.8 ソフトウェア (Molecular Devices LLC) で制御し、100 × 1.4 NA 油浸対物レンズと 1.6 × オプティバールを使用しました。位相コントラスト光学系。 画像処理はフィジーソフトウェアを使用して実行されました。 トリミングされていない画像を補足図1に示します。

マクロコロニーからの画像は、Zeiss Axiocam 503 モノラル CCD カメラを備えた Zeiss Axio Zoom.V16 実体顕微鏡で取得し、1 × 0.25 NA 対物レンズと Bright レンズを使用して Zeiss Zen 2.1 (blue edition) ソフトウェア (Zeiss) で制御しました。フィールド光学系。 画像処理はフィジーソフトウェアを使用して実行されました。 遊泳運動性を測定するために、OD600 ～ 0.7 の細菌懸濁液を BHI 軟寒天プレート (0.3% (w/v) 寒天) に接種しました。 プレートを上向きに25℃で48時間インキュベートし、Gel Doc XR（Bio-Rad）のエピホワイト機能を使用して写真を撮影しました（補足図2）。

一晩増殖させた培養物を新鮮な BHI で 1 回洗浄し、1:100 に希釈し、24 ウェル プレートの各ウェルに 500 μL を加えました。 プレートを静的条件下、37℃で48時間インキュベートしました。 インキュベーション後、バイオフィルムをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 1x w/o Ca2+/Mg2+ (DPBS) (Biowest) で洗浄し、37 °C で乾燥させた後、0.1% (w/v) クリスタルバイオレット溶液を添加しました。 プレートを洗浄し、完全に乾燥させた後、Image Scanner III (GE) を使用してスキャンしました。 各バイオフィルムのバイオマスを定量化するために、33% (v/v) 酢酸を加えて CV を可溶化し、分光光度計 (BioPhotometer plus、Eppendorf) を使用して A595 を測定しました。

滅菌した丸いカバースリップを２４ウェルプレートの各ウェルに置き、「バイオフィルム形成アッセイ」に記載されているように細菌懸濁液を調製した。 37℃で48時間インキュベートした後、バイオフィルムをDPBSで洗浄しました。 次いで、それらを固定溶液（２．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド、１％ホルムアルデヒドおよび０．１Ｍカコジル酸緩衝液、ｐＨ７．４）で固定し、０．１Ｍカコジル酸緩衝液で洗浄した。 濃度を増加させながら（50%、70%、90%、100%）エタノールを使用してサンプルを徐々に脱水し、最後に tert-ブチルアルコールを 2 時間添加し、その後使用するまで -20 °C で冷凍しました。 サンプルは真空条件下で凍結乾燥され、SEM 分析が実行されるまで室温に保管されました。 電子スパッタ（Cressington 108）を使用して10 mAで15秒間、サンプルを金（厚さ約6 nm）でコーティングし、Hitachi SU8010走査電子顕微鏡で1.5 kV、WD 6 mmで画像化しました。

バイオフィルムを滅菌ガラス製の丸いカバースリップ上で 48 時間形成し、その後 DPBS で洗浄しました。 バイオフィルムの厚さを観察するために、バイオフィルムを 3 µM の SYTO™ 9 蛍光色素 (Thermo Fisher Scientific) で染色し、488 nm Ar+ レーザー ライン (発光は 500 ～ 590 nm で収集) とスキャン Z スタックを使用する CLSM によって画像を取得しました。 1.5μmの走査ステップサイズで。 バイオフィルムマトリックスの細胞外 DNA と細菌細胞を観察するには、最初に SYTO™ 9 (Thermo Fisher Scientific) を DPBS 中の 3 μM で添加し、次に TO-PRO™-3 ヨウ化物 (Thermo Fisher Scientific) 蛍光色素を 4 μM の DPBS45 で添加しました。 画像は、それぞれ 488 nm Ar+ レーザー ライン (発光は 500 ～ 590 nm で収集) と 633 nm He-Ne レーザー ライン (発光は 645 ～ 795 nm で収集) を使用して取得されました。 FilmTracer™ SYPRO® Ruby Biofilm Matrix 染色 (Thermo Fisher Scientific) をタンパク質染色に使用しました 47。 画像は 476 nm Ar+ レーザー ライン (発光は 600 ～ 740 nm で収集) を使用して取得されました。 ルテニウムレッド-フェナントロリン (RR-OP) 複合体を使用して、バイオフィルム構造内の多糖を染色しました。 RR-OP 複合体の合成は、Bertolesi らによる修正プロトコールに従いました 50。 簡単に説明すると、20 mg のルテニウム レッド (RR) を 10 mL の蒸留水に溶解し、次に 10 mg の 1,10-フェナントロリン (OP) をその溶液に加えました。 次に、混合物を 100 °C で 50 分間加熱しました。 複合体は暗緑色の溶液として得られ、これをさらに 2 mg/mL でバイオフィルムを染色するために使用されました。 画像は 458 nm Ar+ レーザー ライン (発光は 490 ～ 625 nm で収集) を使用して取得されました。 すべての場合において、63倍の水（開口数1.2）アポクロマート対物レンズを備えたライカTCS SP5倒立顕微鏡を使用した。 画像は、200 Hz で実行された Z スタック測定を除き、100 Hz のスキャン速度で 512 × 512 ピクセルで収集されました。 バイオフィルムの三次元画像は、Imaris ソフトウェア (Bitplane) を使用して構築されました。 バイオフィルムバイオマス、最大厚さ、および粗さ係数は、COMSTAT ソフトウェアを使用して Z スタックから定量化されました83。

Combrouse et al.84 によって以前に記載された定量化方法の適応に従って、バイオフィルムマトリックス成分の抽出と定量化が行われました。 バイオフィルムを収集した後、各懸濁液を氷上でプローブソニケーター（UP 200 s、Dr. Hielscher GmbH）を使用して超音波処理した。 超音波処理後、さらに正規化するために OD600 を測定し、懸濁液を 3100 × g で遠心分離して定量のために上清を収集しました。 バイオフィルムマトリックス中の多糖類の濃度は、グルコースを標準として使用し、フェノール硫酸法によって測定されました85,86。 タンパク質濃度は、Bradford reagent87 (Bio-Rad) を使用し、ウシ血清アルブミンを標準として定量しました。 バイオフィルムマトリックスの細胞外 DNA はフェノール-クロロホルム抽出法 88 によって取得され、その濃度は NanoDropOnec (Thermo Fisher Scientific) を使用して測定されました。

野生型およびΔpnpA変異株におけるゲンタマイシンおよびエリスロマイシンの最小発育阻止濃度（MIC）は、37℃でBHIを含むマイクロタイタープレートでの2倍ブロス微量希釈法の適応を使用して決定されました。 MIC は、抗生物質を阻害する細菌の増殖の最低濃度によって決定されました。 除菌アッセイでは、洗浄後、抗生物質溶液 (BHI 溶液) を 48 時間経過したバイオフィルムに添加し、37 °C で 24 時間インキュベートしました。 次いで、各ウェルを滅菌DPBSで洗浄し、続いて超音波浴中で5分間超音波処理した。 バイオフィルムを除去して回収し、滅菌DPBSで段階希釈を行い、BHI寒天プレートに播種しました。 CFU/mL は、37 °C で一晩インキュベートした後に評価されました。

バイオフィルムをDPBSで洗浄し、続いて緩衝液A(10%(v/v)グルコース、12.5mM Tris pH7.5、H2O中10mM EDTA)を各ウェルに添加し、バイオフィルムを収集した。 細胞溶解は FastPrep®-24 (MP Bio) で実行し、続いてフェノール-クロロホルム法とエタノール 35 で沈殿させました。 Turbo DNase (Thermo Fisher Scientific) を使用してゲノム DNA を除去しました。 RNA の品質と完全性は、アガロースゲル電気泳動と Qubit™ 4 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) によって分析されました。

野生型およびΔpnpA変異株からの2つの生物学的複製の全RNAサンプルを、Illumina HiSeq 4000プラットフォーム（ペアエンド、150 bpリード長、20 Mリード）を使用してSTAB VIDA（ポルトガル）で配列決定しました。 cDNA ライブラリの構築は、QIA FastSelect -5S/16 S/23 S rRNA 除去を備えた Kapa RNA Hyper Prep Library 調製キットを使用して実行されました。 RNA-seq データは、Pobre および Arraiano89 に記載されているワークフローに従って分析されました。 Bowtie2 プログラムを使用して、リードを L. monocytogenes ゲノム (NCBI ゲノム データベースからダウンロードした NC_003210.1) に対してマッピングしました。 データの視覚化は Artemis Genome Browser を使用して実行されました。 発現差解析は、R パッケージedgeR を使用して行われました。 P 値の偽発見率 (FDR) 補正が 0.1 未満であるすべての転写物を有意であるとみなし、3 を超える発現値 (log2 CPM) と 2 を超える 2 つのサンプル間の倍率変化を使用して結果をさらにフィルタリングしました。各菌株の生物学的複製数が少ないため、DEG の過小評価を避けるために、より厳密な値 0.05 ではなく、0.1 未満の P 値の中程度の FDR 補正を使用することを選択しました。 機能アノテーションは、DAVID 機能アノテーション ツールを使用して実行されました。

SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit (Bioline) を使用して、1 μg の精製 RNA から cDNA を合成しました。 定量的 PCR (qPCR) と組み合わせた逆転写は、Real Time Thermal Cycle qTower システム (Analytik Jena) を使用し、供給者の指示に従って SensiFAST SYBR No-ROX キット (Bioline) を使用して実行されました。 qPCR 用のプライマーを補足表 3 に示します。遺伝子発現の相対定量は、2-ΔΔCt 法を使用し、ハウスキーピング参照遺伝子として gyrA (lmo0007) を使用して計算されました。

RNA の安定性を測定するために、細菌培養物を BHI 培地中で 37 °C で撹拌しながら定常期 (OD600 ～ 3) まで増殖させました。 リファンピシンを最終濃度 500 μg/mL で添加することにより、転写をブロックしました。 時点ゼロは、リファンピシンの添加の直前に収集された。 培養サンプルを所定の時点で収集し、0.2 容量の RNA 停止バッファー (1:20 酸性フェノール:エタノール溶液) と混合し、続いて遠心分離し、急速冷凍しました。 ペレットをバッファー A に再懸濁した後、FastPrep®-24 (MP Bio) で細胞溶解を実行し、続いてフェノール-クロロホルム抽出し、エタノールで沈殿させました。 ノーザン ブロット分析では、10 ～ 40 μg の全 RNA を MOPS 緩衝液中の 1% アガロース ホルムアルデヒド変性ゲルで分画しました。 RNAをHybond-N+膜(Cytiva)に転写し、UVC 500装置(Amersham Biosciences)を使用してUV照射によりUV架橋した。 T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Thermo Fisher Scientific)を使用して、DNAオリゴヌクレオチドプローブの5'末端を[γ-32P]-ATP(PerkinElmer)で標識した。 放射性標識プローブは、G25 Microspin カラム (Cytiva) で精製しました。 メンブレンを、PerfectHyb Plus Hybridization Buffer (Sigma-Aldrich) 中で 42 °C で一晩ハイブリダイズさせ、FUJI TLA-5100 スキャナー (Fujifilm) を使用して分析しました。 RNAの半減期は、0分におけるRNAの量を100%とみなして、時間に対する残存RNAのパーセンテージの対数を使用する線形回帰によって決定した。 ノーザンブロットの未処理画像を補足図に示します。 この研究で使用したオリゴヌクレオチドプローブは補足表 3 にリストされています。

Plmo0048-lacZ および Plmo2006-lacZ 転写融合ベクターを構築するために、適切なプライマーペアを使用した PCR を使用して各遺伝子のプロモーター領域を増幅しました (補足表 3)。 PCR産物をEcoRIおよびBamHI（Thermo Fisher Scientific）で消化し、プロモーターのない大腸菌lacZ（pTCV-lacZ）54を担持する低コピー数のpTCVベースの発現ベクターの対応する部位に挿入した。 得られたプラスミド構築物を大腸菌S17-1に形質転換し、これをL.モノサイトゲネスEGD-e WTおよび同質遺伝子型ΔpnpA変異体との結合90に使用した。

プロモーター活性は、pTCVプラスミド54を用いてβ-ガラクトシダーゼ活性を測定することにより分析した。 細胞を BHI 培地中で 37 °C で撹拌しながら定常期 (OD600 ～ 3) まで増殖させました。 収集したサンプル (1 mL) を遠心分離し、ペレットを急速冷凍しました。 ペレットを1 mLのZ緩衝液(60 mM Na2HPO4、40 mM NaH2PO4、10 mM KCl、1 mM MgSO4、50 mM β-メルカプトエタノール、pH 7.0)に再懸濁し、OD600を測定した。 細胞は、0.5% トルエンおよび 4.5% エタノールを用いて、水浴中 30 °C で 5 分間透過処理されました。 β-ガラクトシダーゼ活性を測定するために、4 mg/mL o-ニトロフェニル-β-d-ガラクトピラノシド (ONPG、Sigma-Aldrich) を含む 200 μL の Z バッファーを各サンプルに添加し、続いて水中で 30 °C でインキュベートしました。バス。 500 μL の 1 M NaCO3 を加えて反応を停止し、時間を記録しました。 21,000 × g で 5 分間遠心分離した後、420 ​​nm での吸光度を測定しました。 β-ガラクトシダーゼ活性（ミラー単位）は、（1000 × A420）/（T × V × OD600）として計算されました。 T、反応時間（分）。 V、細菌の体積（mL）。

全タンパク質を抽出するには、細菌培養物を BHI 培地中で 37 °C で撹拌しながら定常期 (OD600 ～ 3) まで増殖させ、その後遠心分離しました。 FastPrep®-24 (MP Bio) で細胞溶解を実行し、上清からタンパク質抽出物を回収しました。 タンパク質の定量化は、上記と同様にブラッドフォード試薬を使用して実行されました。

タンパク質サンプルを、Bolt™ 抗酸化剤 (0.25%) を添加した MOPS 1X バッファーを含むBolt™ 4 ～ 12% Bis-Tris Plus Gel (Invitrogen™) にロードし、Mini Gel Tank システム (Invitrogen™) を使用しました。 ニトロセルロース膜への転写は、Mini Blot Module (Invitrogen™) を使用して実行されました。 タンパク質検出のために、膜をブロッキング溶液 (TBS + 0.1% Tween-20 (TBS-T) + 5% の脱脂粉乳) で 1 時間ブロックし、以下の一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました: ウサギTBS-T中のα-InlA 1:5000 (Cusabio)またはウサギα-EF-Tu 1:40000 (Abcam)。 二次抗体ヤギ α-ウサギ IgG-HRP 1:20,000 (Sigma) を 4 °C で 1 時間インキュベートしました。 検出は、iBright™ CL1500 Imaging System で Western Lightning® Plus-ECL Enhanced Chemiluminescent Substrate (PerkinElmer) を使用した化学発光によって実行されました (補足図 5)。 画像は、Fiji ソフトウェアを使用して定量化されました。

実験データは、GraphPad Prism バージョン 8.0.1 (GraphPad ソフトウェア) を使用して分析されました。 スチューデントの t 検定は、ほとんどの実験の統計的有意性を決定するために使用されました。 抗生物質による治療と対照の比較は、二元配置分散分析を使用して実行されました。 データは、平均値 ± 標準偏差 (SD) または平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表示されます。 <0.05 の AP 値は統計的に有意であるとみなされました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この出版物で議論されているデータは NCBI の Gene Expression Omnibus に寄託されており、GEO シリーズのアクセッション番号 GSE210097 を通じてアクセスできます。

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この研究は、MOSTMICRO-ITQB R&D ユニット (UIDB/04612/2020、UIDP/04612/2020) を通じて、FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP によって支援されました。 LS4FUTURE 関連研究所 (LA/P/0087/2020); PTDC/BIA-MIC/32525/2017 を気象庁に付与。 APQ への博士フェローシップ (PD/BD/135487/2018); FCT は DL57/2016 に従って SNP (SFRH/BPD/92409/2013) および VP (SFRH/BPD/87188/2012) と契約します。

António Xavier Institute of Chemical and Biological Technology, New University of Lisbon (ITQB NOVA), Avenida da República, 2780-901, Oeiras, Portugal

アナ・パトリシア・クエンデラ、ヴァニア・ポブレ、セシリア・マリア・アライアーノ、ホセ・マルケス・アンドラーデ

生物工学・生物科学研究所 (IBB) および関連研究所 - 健康・生物経済研究所 (i4HB)、Instituto Superior Técnico、リスボン大学、Av. Rovisco Pais、1049-001、リスボン、ポルトガル

サンドラ・ヌネス・ピント & バスコ DB ボニファス

画像、ナノ形態学、および X 線分光法 (Linx) 生物化学防衛ユニット軍事研究所 (UMLDBQ)、陸軍大学研究所、陸軍士官学校研究イノベーション開発センター、Av. Dr Alfredo Bensaúde、1100- 471 、リスボン、ポルトガル

ウィルソン・アントゥネス

生物工学部、Instituto Superior Técnico、リスボン大学、Av. Rovisco Pais、1049-001、リスボン、ポルトガル

バスク DB ボニファティウス

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気象庁がこのプロジェクトを発案しました。 APQ、SNP、気象庁がこの研究を企画した。 CMA と JMA は APQ の作業を共同監督しました。 APQ、SNP、WA、VDBB、JMA が実験を実施しました。 APQ、SNP、VP、JMA がデータを分析しました。 気象庁はプロジェクトの管理と資金調達を行いました。 APQと気象庁が記事を執筆した。 著者全員が原稿の最終版の議論、レビュー、編集に貢献しました。

ホセ・マルケス・アンドラーデ氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Quendera、AP、Pinto、SN、Pobre、V. 他リボヌクレアーゼ PNPase は、リステリア モノサイトゲネスにおけるバイオフィルム形成の重要な調節因子であり、宿主細胞の侵入に影響を与えます。 npj バイオフィルム マイクロバイオーム 9、34 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41522-023-00397-1

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受信日: 2022 年 10 月 25 日

受理日: 2023 年 5 月 18 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00397-1

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